CHO 残留 DNA 检测试剂盒(PCR-荧光探针法)试剂盒简介：

CHO 残留DNA 检测试剂盒是用于定量检测各种生物制品及药品的中间品、半成品和成 品中残留的 CHO  宿主细胞 DNA。
本试剂盒利用 Taqman 探针法， 定量检测样本中 CHO  残留 DNA。该方法具有速度快、 特异性高、  性能可靠且 检测限可达到 fg 级别。
试剂盒组份：

表 1：试剂盒组份

试剂 装量 贮存条件
CHO control DNA 40ul×1 管 -20oC
DNA dilution buffer 6ml ×1 瓶 -20oC
2×Taqman master mix (+UNG/ROX) 0.75ml ×2 管 -20oC
10×CHO qPCR mix 0.3ml ×1 管 -20oC
RNase-Free H2O 1.5ml×1 管 -20oC
规格 ：100  反应
适用机型：
PRISM 7500 Real-Time PCR System (ABI)
StepOne Plus Real-Time PCR System (ABI)
LightCycler 480 (Roche)
AriaMX (Agilent Technologies)
CFX (BIO-RAD)

实验所需但试剂盒未包含材料：

? 1.5ml 无菌低吸附离心管
? 96 孔 qPCR  板
? 一次性手套
? 1000ul 、100ul 、10ul 无菌低吸附带滤芯移液枪头

实验操作过程：

一、 CHO DNA 定量参考品的稀释及标准曲线的制备

用试剂盒中提供的 DNA dilution buffer 将 CHO control DNA 进行梯度稀释， 稀释浓度依 次为 300pg/ul 、30pg/ul 、3pg/ul 、300fg/ul 、30fg/ul 、3fg/ul 。具体操作如下：

1.将试剂盒中的 CHO control DNA 和 DNA dilution buffer 置于冰上融化，待完全融化后，

轻微振荡混匀，简短快速离心。

2.取 6 支干净的 1.5ml 离心管，分别标记为 SD1 ，SD2 ，SD3 ，SD4 ，SD5, SD6。

3，SD1 管中加入 198ul DNA dilution buffer，其余管中分别加入 180ul DNA dilution buffer。

4,取 2ul  CHO  control  DNA 加入 SD1 管中， 然后涡旋振荡混匀 5- 10s 后短时快速离心 5s，涡旋振荡和快速离心各重复 3 次。

5,按表 2 依次进行 6 次梯度稀释操作，稀释操作同步骤 4。

表 2. CHO control DNA 的稀释

稀释管	稀释体积	浓度
SD1	2ul CHO control DNA+198ul DNA dilution buffer	300 pg/ul
SD2	20ul SD1+180ul DNA dilution buffer	30 pg/ul
SD3	20ul SD2+180ul DNA dilution buffer	3 pg/ul
SD4	20ul SD3+180ul DNA dilution buffer	300 fg/ul
SD5	20ul SD4+180ul DNA dilution buffer	30 fg/ul
SD6	20ul SD5+180ul DNA dilution buffer	3 fg/ul

二、加样回收质控 ERC 的制备

根据待测样本的残留量设置 ERC 中 CHO  control  DNA 的加样浓度 (以制备加 45pg  CHO control DNA 的样本 ERC 为例)，操作如下：

1，取待测样本 100u，加至 1.5ml 干净的离心管中；

2，加入 1.5ul SD2，混匀，标记为样本 ERC。

注：样本 ERC 和同批待测样本需一起进行样本前处理。

三、阴性质控 NEG 的制备

根据实验设置阴性质控，操作如下：

1，取 100ul 样本基质溶液(或洗脱液)加至 1.5ml 干净的离心管中标记为阴性质控 NEG。 注：阴性质控 NEG 样本和同批待测样本需一起进行样本前处理。

四、 qPCR 反应液的制备和加样

1，根据所要检测的标准曲线及待测样本数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。

反应孔数=  (6 个浓度梯度+1 个无模板对照 NTC+1 个阴性质控 NEG+待测样本×2) ×3 注：待测样本×2 是为了让每个待测样本检测时都同时做样本 ERC 。                  2，根据反应孔数计算本次实验所需的各组分的所需总量以制备 pre-mix：

2×Taqman master mix=(反应孔数+2) ×15ul    (含有 2 孔的损失量)

10×CHO qPCR mix=  (反应孔数+2) ×3ul

RNase-free H2O=  (反应孔数+2) ×2ul

3，各试剂置于冰上融化，振荡混匀，按表 3 所示进行加样：

表 3.各反应孔加样示例

标准曲线	20ul pre-mix+ 10ul SD1/SD2/SD3/SD4/SD5/SD6
NTC	20ul pre-mix+ 10ul DNA dilution buffer
NEG	20ul pre-mix+ 10ul NEG
待测样本	20ul pre-mix+ 10ul 待测样本
ERC 样本	20ul pre-mix+ 10ul ERC 样本

注：加样完成后每孔总体积为 30ul。