概述：
荧光定量PCR的基本原理就是在PCR扩增过程中，随着PCR循环数的递增，PCR产物不断积累，荧光信号也会相应的增加，这样就可以通过荧光强度的变化来对PCR反应进行实时的监测。产品仅供科研使用本公司根据您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探针法。通过对DNA或RNA的荧光定量PCR监测, 实现基因的相对定量、定量和定性分析。

实时荧光定量PCR：
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性*的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物考核、病原体检测等诸多领域。
探针荧光定量PCR试剂盒原理分析如下图：

使用方法：
一、河流弧菌探针法荧光定量PCR试剂盒稀释PCR阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
8. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）?？梢杂?/span>10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号（浓度为1×10E4 拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5 拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。
9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。
三、设置qPCR反应（20 μL体系，在样品制备室进行）
10. 如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。
11. 产品仅用于科研在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加）

荧光定量PCR服务：
产品仅供科研使用简介：实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果等。我公司为您提供全套实时荧光定量PCR技术服务，全部实验皆使用进口试剂完成，主要定量PCR仪器。
1、荧光定量PCR服务要求：
（01）请您提供新鲜的且尽量多的材料；或直接提供纯化好的总RNA（大于 5 ug/样品）；或直接提供纯化好的DNA（大于 5 ug/样品）。
（02）请提供已知的全长基因序列。
（03）请提供尽可能详细的背景资料：DNA/RNA 来源等
2、荧光定量PCR操作程序
（01）引物（探针）设计与合成。
（02）提取DNA/RNA，样本逆转录成cDNA。
（03）进行Real Time PCR实验，进行实验结果分析。
（04）实验完成后，提供完整的实验报告（含软件分析结果）及引物等实验材料。
3、荧光定量PCR的收费标准：
  我公司根据客户的样品数量进行不同的收费标准。
人绒毛膜内皮细胞 人胚胎皮肤成纤维细胞，CCC-ESF-1细胞 Sol8(小鼠骨骼肌肌肉母细胞)儿价分橙四钠100克

人细胞;Hela S3 [HeLaS3]5-羌基烟醋 5-xy7noxynicotinic ccid 788-71-3

ICAM1 Others Mouse 小鼠 ICAM-1 / CD54 人细胞裂解液 (阳性对照) wo7iumCHLORITE亚录酸钠1 KgRT

人成细胞;MG-63厌氧菌靛基质试验培养基100克

IL12A&IL27B Others Human 人 IL12A & IL27B Heterodimer 人细胞裂解液 (阳性对照) (D-葡萄糖-1-1酸二钠)
SLIK4 Others Human 人 SLIK4 / Slik4 人细胞裂解液 (阳性对照) ?；侵砣パ醯ㄋ崮浦柿抗娓瘢骸?/span>98%,美国进口 taurohyodeoxycholate hydrate

Calu-3 人(胸膜渗出液)磺丁基-β-环糊精;磺丁基倍他环糊精钠质量规格：>99%,USPCaptisol( beta-Cyclodextrin, sulfobutyl ethers,  salts)

BGC-823-EGFP-puro人细胞 Human gasic cancer cells BGC-823-EGFP-puro 1640+10% Hyclone灭活血清+2ug/ml puromycin缬氨霉素质量规格：>95% (HPLC),进分Valinomycin

BMP2 Protein Human 重组人 BMP-2 蛋白 (Fc 标签)5-氯-1，3-二甲基吡唑 质量规格：>98%，原装进口5-Chloro-1,3-dimethyl-1H-pyrazole

人微内皮细胞 (HCMEC)( 5×105 ) SF9, 昆虫卵巢细胞 其它甘氨鹅脱氧胆酸钠质量规格：>97%,BRGlycochenodeoxycholic Acid  Salt
EB病毒转化的人B细胞;KMYBDL-天冬酸1克RT

GFRA3 Others Human 人 GFRA3 / GFR-alpha-3 人细胞裂解液 (阳性对照) 钛醋钡 Bcrium titcnctq 1047-7-7

SV40转染人成骨细胞;hFOB 1.19AGAROSEIV高强度琼脂糖100G

人食道上皮细胞(HEEC)(5×105 )无水录化亚锡，英文名或英文缩写：Tin(II) chloride anxy7nous，级别：高，99%，带2水，规格：1克

CL-0390NCI-H1703(人肺鳞癌细胞)5×106cells/瓶×2534-8-41，3-二录(剧毒)1,3-Dichloroeetone
河流弧菌探针法荧光定量PCR试剂盒CDC37 Others Mouse 小鼠 CDC37 / CDC37A 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) α-烟酰胺腺嘌呤二核苷1酸,缩减二钠盐α-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced di salt质量规格：美国进口

肾小球内皮细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)β-NADP-二醛β-NADP-dialdehyde质量规格：美国进口

草鱼肝脏细胞;L8824 人视网膜母细胞瘤，WERI-Rb-1细胞 KB(口腔表皮样癌细胞)9-苯基蒽(>98.0%(GC))9-Phenylanthracene质量规格：>98.0%(GC)

人细胞;SF767N-苯基-9-蒽胺(>98.0%(GC))N-Phenyl-9-anthramine质量规格：>98.0%(GC)

REG1B Others Human 人 REG1B / PSPS2 人细胞裂解液 (阳性对照)  1-萘(>98.0%(GC))1-Iodonaphthalene质量规格：>98.0%(GC)
实验过程：
一、试剂准备
1. DNA模板
2．对应目的基因的特异引物（在PCR反应中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制，而不能从无到有，凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物?？梢允?/span>DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根据你的模板链设计。因此，扩增不同的基因需要设计不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步骤
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
４．PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。
６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。