马红球菌探针法荧光定量PCR检测试剂盒使用方法

马红球菌探针法荧光定量PCR检测试剂盒使用方法:

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

按照试剂盒操作说明或者微生物样品处理方法做好样品前处理。

1.2 DNA 提取

根据您实验室的具体情况和样品类型，选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠，我们建议使用商品化的试剂盒进行提取，严格按照对应试剂盒说明书进行操作，样本核酸提取过程中应避免污染，提取好的模板样品如不能立即检测，建议-15℃以下保存。

推荐采用我们公司研发生产的试剂盒：Hypure 病毒基因组 DNA 提取试剂盒

2. 试剂配制（试剂准备区）

2.1 从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温（20～25℃），注意避免强光照射，待完全溶解后振荡混匀并低速离心 10 s，使用低吸附吸头分液取样，避免试剂损失和浪费。

2.2 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂

鲑肾杆菌反应液

鲑肾杆菌扩增液

用量（样本数为N）

19.5μL

0.5μL

2.3 在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后 2000 rpm 离心 10 s，按照 20 μL/管分装量将试剂分装至八联 PCR 反应管中。

2.4 盖紧八联 PCR 反应管盖, 并注意做好相应标识（请标记在八联 PCR 反应管盖两端突出部位，切勿标记在八联 PCR 反应管盖中间，以免影响信号采集）。将 PCR 反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1.2 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心，核酸加样过程中应避免污染。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内, 并记录放置顺序。

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25 μL；

荧光通道选择：检测通道选择 FAM， 淬灭通道选择 NONE，参比荧光选 NONE。

4.4 推荐循环参数设置：

步骤

循环数

温度

时间

收集荧光信号

1

1 cycle

95℃

3min

否

2

40 cycle

95℃

15sec

否

55℃

30sec

否

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道 Ct 值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现 Ct 值≤38.0 和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：检测结果 Ct 值无 Ct 值，无明显的扩增曲线。

6. 质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤30；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7. 产品性能指标

阴阳性参考品符合率：5 份阳性参考品符合率为 100％；10 份阴性参考品符合率为 100％。

最低检测限：1.0×103copies/mL。

精密度：批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数（CV）均小于等于 3%。

8. 检测方法的局限性

样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。